A szokványos koponyaröntgen csak kevés segítséget nyújt az agytumorok diagnózisához, a meningeomák és a hipofízis (agyalapi mirigy) adenoma ritka kivételével. Az összes agytumor típus általában komputertomográfia (CT) vagy mágneses magrezonancia vizsgálat (MRI) segítségével mutatható ki, melyekkel meg lehet mérni a tumor méretét és meg lehet adni a pontos helyét. További vizsgálatokat végeznek a típus meghatározására, amennyiben a CT vagy MRI felvételen az agytumor látható.

Az agyalapi mirigy (hipofízis) tumorokat általában akkor fedezik fel, amikor azok idegeket nyomva látászavart okoznak. A vérvizsgálatok rendellenes agyalapi mirigy hormonszinteket mutatnak, és a daganat általában CT vagy MRI vizsgálattal diagnosztizálható.

Más tumorok is okozhatnak a vérben kóros hormonszinteket, de többségükre ez nem jellemző. Biopsziát kell venni a tumorból (eltávolított anyagdarabka, amit mikroszkóp alatt megvizsgálnak), hogy meghatározzák a tumor típusát és azt, hogy rosszindulatú-e.

Néha a gerinccsapolással (lumbálpunkció) nyert agy-gerincvelői folyadék mikroszkópos vizsgálata rákos sejteket mutat. Gerinccsapolás nem végezhető el agynyomás-fokozódás esetén, mert a hirtelen nyomásváltozás beékelődést (herniáció) okozhat, ami az egyik legveszélyesebb lehetséges szövődménye az agytumornak. A beékelődés során a megnövekedett nyomás az agyszövetet a koponya alapján levő szűk nyíláson keresztül lefelé nyomja, és ez az alsóbb agyterületek (agytörzs) nyomását okozza. Ennek eredményeképp az életfontos agytörzsi működések (légzésszám, szívritmus és vérnyomás) zavara lép föl. Ha a beékelődés jeleit nem veszik észre és nem kezelik korán, akkor végső fokon kómát és halált okozhat.

A rendszerint a műtét alkalmával elvégzett biopszia során az egész tumort, vagy csak egy részét távolítják el. Az agy belső részein lévő tumorok néha hozzáférhetetlenek, azaz biztonságosan és közvetlenül nem elérhetők. Ilyen esetekben tűbiopsziára kerül sor. Az eljárás során speciális képalkotó segítségével követik a tű beszúrását, majd sejteket szívnak ki.